Rapida riprogrammazione metabolica mediata dall'AMP

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Nature Communications volume 14, numero articolo: 422 (2023) Cita questo articolo 2062 Accessi 17 Dettagli metriche altmetriche L'onnipresente agente patogeno Toxoplasma gondii ha uno stile di vita complesso con

Nature Communications volume 14, numero articolo: 422 (2023) Citare questo articolo

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L'onnipresente agente patogeno Toxoplasma gondii ha uno stile di vita complesso con diverse attività metaboliche in diverse fasi che sono intimamente legate agli ambienti parassitari. Qui abbiamo identificato il regolatore eucariotico dell'omeostasi cellulare della proteina chinasi attivata da AMP (AMPK) nel Toxoplasma e scoperto il suo ruolo nella programmazione metabolica durante il ciclo litico del parassita. La subunità catalitica AMPKα viene rapidamente fosforilata dopo il rilascio di parassiti intracellulari in ambienti extracellulari, guidando il catabolismo produttore di energia per potenziare la motilità dei parassiti e l’invasione nelle cellule ospiti. Una volta all’interno delle cellule ospiti, la fosforilazione di AMPKα viene ridotta al livello basale per promuovere un equilibrio tra produzione di energia e sintesi di biomassa, consentendo una robusta replicazione del parassita. L’esaurimento di AMPKγ abolisce la fosforilazione di AMPKα e sopprime la crescita del parassita, che può essere parzialmente salvata sovraesprimendo AMPKα di tipo selvatico ma non i mutanti di fosforilazione. Pertanto, attraverso la riprogrammazione ciclica da parte dell'AMPK, le esigenze metaboliche dei parassiti in ogni fase sono soddisfatte e il ciclo litico progredisce in modo robusto.

I cambiamenti nelle condizioni ambientali sono sfide che tutti gli organismi viventi devono affrontare. A causa dello stile di vita unico, gli organismi parassiti sono particolarmente abili nel rispondere e nell'adattarsi ai cambiamenti ambientali. Il Toxoplasma gondii, un protozoo ubiquitario che infetta un terzo della popolazione umana mondiale e numerosi animali, è in grado di crescere e sopravvivere in condizioni ospiti e ambientali estremamente diverse1,2. Questo parassita ha un ciclo vitale complesso in cui si alternano più fasi che sono fondamentali per la sua patogenesi e trasmissione. Durante l'infezione acuta degli ospiti intermedi, i parassiti proliferano rapidamente come tachizoiti, responsabili dei sintomi clinici della toxoplasmosi3. I tachizoiti invadono attivamente le cellule ospiti, si replicano in esse e poi le lisano per iniziare nuove invasioni quando il numero di parassiti raggiunge un certo numero. In condizioni ottimali, i parassiti crescono continuamente come tachizoiti e ripetono il ciclo litico. Tuttavia, in condizioni di stress o di fame, i tachizoiti possono convertirsi in una forma meno attiva chiamata bradizoiti, che sono racchiusi in cisti tissutali e mantengono un'infezione cronica per tutta la vita negli ospiti1,2,4.

I parassiti del toxoplasma hanno attività metaboliche diverse in fasi diverse. La maggior parte degli enzimi glicolitici ha due isoforme, molte delle quali mostrano un'espressione specifica per lo stadio5,6, indicando requisiti distinti dell'attività glicolitica in diversi stadi. Allo stesso modo, i bradizoiti e le oocisti accumulano grandi quantità di amilopectina, che è appena riscontrabile nei tachizoiti7,8,9. Il significato fisiologico e i meccanismi regolatori sottostanti per tale metabolismo specifico dello stadio sono in gran parte sconosciuti. Il ciclo litico dei tachizoiti contiene due fasi, una breve fase extracellulare in cui i parassiti appena emessi utilizzano la motilità di scorrimento per trovare e invadere le cellule ospiti, e una fase intracellulare in cui i parassiti invasi proliferano all'interno delle cellule ospiti. Dal punto di vista metabolico, l’obiettivo primario dei tachizoiti extracellulari è generare energia sufficiente per alimentare un’invasione rapida ed efficiente, mentre i parassiti intracellulari necessitano di una produzione equilibrata di energia e di sintesi di macromolecole per replicarsi. È stato osservato che l'enzima glicolitico fruttosio-bifosfato aldolasi si rilocalizza dal citoplasma alla periferia del parassita non appena i parassiti vengono rilasciati dalle cellule ospiti10. Poiché il complesso motorio che guida la motilità del parassita si trova sotto la membrana del parassita, si pensava che la rilocalizzazione degli enzimi glicolitici fosse un modo per generare rapidamente energia nei luoghi in cui è necessaria11. Inoltre, trattando i tachizoiti con glucosio marcato con 13C per monitorare il flusso di carbonio derivato dal glucosio, è stato dimostrato che sebbene il 13C potesse essere incorporato in modo efficiente in macromolecole come gli acidi grassi nei parassiti intracellulari, veniva a malapena incorporato in tali molecole nei parassiti extracellulari12. Queste osservazioni suggeriscono che, sebbene lo stadio extracellulare sia molto breve e dura da pochi secondi a minuti, il suo metabolismo è fondamentalmente diverso da quello dei parassiti intracellulari. Il modo in cui questa transizione metabolica di breve durata viene regolata e raggiunta è completamente sconosciuto.

1.5 fold (p < 0.05), 24 of which were decreased and 23 were increased after AMPKγ depletion (Fig. S10, Supplementary data 3). On the other hand, the abundance of 325 phospho-peptides had an abundance change over 1.5 fold after AMPKγ depletion. After adjustments with the protein level changes (to rule out the change of phospho-peptides abundance was caused by changes in protein level), the abundance of 285 phospho-peptides corresponding to 170 proteins was changed >1.5 fold (p < 0.05) upon AMPKγ depletion (Supplementary data 4). More than 40% (74/170 = 43.5%) of these proteins are hypothetical proteins with unknown functions. Besides those, a large number of proteins with metabolic roles, including enzymes, transporters and regulators, were differentially phosphorylated in the AMPKγ+ versus AMPKγ- parasites. Notably, the glycolytic enzymes pyruvate kinase 1 (PYK1) and fructose-1,6-bisphosphate aldolase (ALD), as well as the major glucose importer glucose transporter 1 (GT1) all contained two or more phospho-peptides that had abundance difference between AMPKγ expressing and depleted parasites (Fig. 7a). Other proteins involved in sugar breakdown or energy metabolism, including 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD), acetyl-coenzyme A synthetase (ACS) and pyruvate dehydrogenase kinase also showed changes in phosphorylation at specific serine residues upon AMPKγ degradation (Fig. 7a, Supplementary data 4). Similarly, a number of proteins and enzymes involved in anabolism such as lipid and protein synthesis also displayed phosphorylation changes after AMPKγ depletion (Fig. 7b, Supplementary data 4). Particularly, the phosphorylation of three eukaryotic initiation factors (eIF2B, eIF4A and eIF4G) that control the initiation of protein translation was reduced upon AMPKγ degradation (Fig. 7b), which is consistent with the impaired nascent protein synthesis of AMPKγ depleted parasites (Fig. 5d)./p> 1.5) changed after TgAMPKγ depletion. These include many metabolic enzymes and regulators, such as pyruvate kinase 1, fructose-1,6-bisphosphate aldolase, glucose transporter GT1 and pyruvate dehydrogenase kinase that are involved in sugar breakdown and ATP production45,46,47, as well as a number of eukaryotic initiation factors and CDP-alcohol phosphatidyltransferase that are involved in the synthesis of proteins and phospholipids. Many of these proteins were also identified in the co-IP experiments as potential interaction proteins with AMPK. These proteins are possible targets of AMPK in Toxoplasma. Further studies are needed to dissect how exactly they are regulated by AMPK and the physiological significance of such regulation. On the other hand, when some of the differentially phosphorylated proteins listed in Fig. 7 (such as GT1, ALD, PYK1 and ACS) were analyzed in detail to see whether the residues potentially phosphorylated by TgAMPK were conserved among other organisms. Interestingly, while orthologs of these proteins are present in model eukaryotes from yeasts to fruit flies and humans, the phosphorylated residues within them are either not conserved or do not have evidence of AMPK-dependent phosphorylation. These results suggest that either the proteins analyzed are not direct substrates of TgAMPKα, but other kinases whose activities are influenced by TgAMPKα, or the detailed mechanisms by which Toxoplasma AMPK regulates parasite metabolism are different from that of other eukaryotes./p> 10,000 parasites being analyzed for each sample. Each strain and condition were tested three times independently./p> 0.05), phosphorylation sites with log2 (phospho fold-change) ≥ 0.58 and p-value ≤ 0.05 were considered as differentially phosphorylated./p>

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